Acidic Environment Induces Pyroptosis of NLRP3 Inflammatory Vesicle-Mediated Nucleus Pulposus Cells Through Up-Regulation of POSTN Expression

SUMMARY: Intervertebral disc degeneration (IVDD) is induced by nucleus pulposus (NP) dysfunction as a result of massive loss of NP cells. It has been reported that the acidic microenvironment of the intervertebral disc (IVD) can induce NP cell pyroptosis, and that up-regulation of periostin (POSTN) expression has a negative effect on NP cell survival. However, the relationship between the acidic environment, POSTN expression level and NP cell pyroptosis is unclear. Therefore, the aim of this study was to explore the relationship between acidic environment and POSTN expression level in NP cells, as well as the effect of POSTN in acidic environment on NP cell pyroptosis. NP cells were obtained from the lumbar vertebrae of Sprague Dawley (SD) male rats. These cells were divided into normal and acidic groups according to whether they were exposed to 6 mM lactic acid solution. And NP cells in the acidic group were additionally divided into three groups: (1) Blank group: no transfection; (2) NC group: cells transfected with empty vector plasmid; (3) sh-POSTN group: cells transfected with sh-POSTN plasmid to knock down the expression level of POSTN. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and western blot was performed to assess the expression of POSTN at the mRNAand protein levels. CCK8 was used to evaluate cell survival. Western blot, in addition, was performed to examine acid-sensing ion channels (ASIC)-related proteins. And pyroptosis was detected by ELISA and western blot. The expression level of POSTN was significantly increased in NP cells in acidic environment. Knockdown of POSTN expression promoted the survival of NP cells in acidic environment and reduced the protein levels of ASIC3 and ASIC1a in NP cells. Moreover, knockdown of POSTN expression decreased the pyroptosis proportion of NP cells and the levels of pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β and IL-18. The levels of pyroptosis-related proteins NLRP3, ASC, cleaved-Caspase-1, and cleaved-GSDMD were also affected by the decreased POSTN expression. The extracellular acidic environment created by lactic acid solution activated NLRP3 inflammatory vesicle-induced caspase-1 to get involved in NP cell pyroptosis by up-regulating POSTN expression.

La degeneración del disco intervertebral (DDIV) es inducida por una disfunción del núcleo pulposo (NP) como resultado de una pérdida masiva de células NP. Se ha informado que el microambiente ácido del disco intervertebral (DIV) puede inducir la piroptosis de las células NP y que la regulación positiva de la expresión de periostina (POSTN) tiene un efecto negativo en la supervivencia de las células NP. Sin embargo, la relación entre el ambiente ácido, el nivel de expresión de POSTN y la piroptosis de las células NP es poco clara. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue explorar la relación entre el ambiente ácido y el nivel de expresión de POSTN en células NP, así como el efecto de POSTN en ambiente ácido sobre la piroptosis de las células NP. Las células NP se obtuvieron de las vertebras lumbares de ratas macho Sprague Dawley (SD). Estas células se dividieron en grupos normales y ácidos según se expusieron a una solución de ácido láctico 6 mM. Las células NP en el grupo ácido se dividieron adicionalmente en tres grupos: (1) Grupo en blanco: sin transfección; (2) grupo NC: células transfectadas con plásmido vector vacío; (3) grupo sh-POSTN: células transfectadas con plásmido sh-POSTN para reducir el nivel de expresión de POSTN. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y una transferencia Western para evaluar la expresión de POSTN en los niveles de ARNm y proteína. Se utilizó CCK8 para evaluar la supervivencia celular. Además, se realizó una transferencia Western para examinar las proteínas relacionadas con los canales iónicos sensibles al ácido (ASIC). La piroptosis se detectó mediante ELISA y Western blot. El nivel de expresión de POSTN aumentó significativamente en células NP en ambiente ácido. La eliminación de la expresión de POSTN promovió la supervivencia de las células NP en un ambiente ácido y redujo los niveles de proteína de ASIC3 y ASIC1a en las células NP. Además, la eliminación de la expresión de POSTN disminuyó la proporción de piroptosis de las células NP y los niveles de citocinas proinflamatorias interleucina (IL) - 1β e IL-18. Los niveles de proteínas relacionadas con la piroptosis NLRP3, ASC, Caspasa-1 escindida y GSDMD escindida también se vieron afectados por la disminución de la expresión de POSTN. El ambiente ácido extracelular creado por la solución de ácido láctico activó la caspasa-1 inducida por vesículas inflamatorias NLRP3 para involucrarse en la piroptosis de las células NP mediante la regulación positiva de la expresión de POSTN.

Is periostin useful as a biomarker for fibrous dysplasia? / ¿Es útil periostina como biomarcador de displasia fibrosa?

Fibrous dysplasia (FD) is an infrequent non-hereditary bone disease caused by a somatic mutation of the GNAS gene. Periostin is a novel marker that increases during tissue healing and fibrous or inflammatory diseases. We conducted an exploratory case-control study to evaluate sensitivity of periostin as a biomarker of FD. The study comprised 15 patients with FD, and healthy age- and sex-matched subjects (controls). Serum periostin levels were assessed and comparisons were established between FD patients and controls, and between patients with the monostotic and the polyostotic form of FD. No statistically significant differences in serum periostin levels were observed between the cohort of FD patients studied here and the control group (FD: 51.1±10ng/ml vs. control: 44.2±15ng/ml; p=0.15), or between the clinical forms of FD (polyostotic: 51.8±9.1ng/ml vs. monostotic: 49.6±13 ng/ml; p=0.66). A sub-analysis performed to compare serum levels of periostin in FD patients with and without a history of fractures showed no statistically significant differences [fracture patients (n=4): 41.2±17ng/ml vs. non-fracture patients (n=11): 49.9±11 ng/ml; p=0.47].Lastly, sensitivity of periostin as a biomarker of FD was analyzed, and was found to have low sensitivity to estimate disease activity [ROC curve; cut-off points: 39.625(0.867-0.467)]. To conclude, in the cohort of FD patients studied here, periostin serum levels did not differ significantly from those of the control group or between the two forms of the disease, and showed low sensitivity as a biomarker of the disease. (AU)

La displasia fibrosa (DF) es una enfermedad infrecuente del hueso, no hereditaria producida por una mutación somática del gen GNAS. Periostina (Postn) es un novedoso marcador, cuyos niveles séricos se encuentran elevados en los procesos de reparación tisular, enfermedades fibrosas o inflamatorias. Llevamos a cabo un estudio exploratorio caso-control para evaluar la sensibilidad de Postn como biomarcador de DF. Se incluyeron en el estudio 15 pacientes con DF apareados por edad y género con sujetos sanos (controles) en los cuales se evaluó los niveles séricos de Postn en pacientes con DF y controles y según forma de presentación clínica. No observamos diferencias estadísticamente significativas en los niveles séricos de Postn y el grupo control (DF: 51.1±10ng/ml vs. control: 44.2±15ng/ml; p=0.15) como así tampoco por forma clínica de DF (poliostótica: 51.8±9.1ng/ml vs. monos-tótica: 49.6±13 ng/ml; p=0.66). Posteriormente realizamos un sub-análisis para evaluar los niveles séricos de Postn en los pacientes con DF y antecedentes de fracturas no observan-do diferencias estadísticamente significativas [fracturados (n=4): 41.2±17ng/ml vs. no frac-turados (n=11): 49.9±11 ng/ml; p=0.47]. Por último analizamos la sensibilidad Postn como biomarcador de DF, mostrando este poseer escasa sensibilidad para estimar actividad de la enfermedad [curva ROC; puntos de corte: 39.625 (0.867-0.467)]. En conclusión, los ni-veles séricos de Postn en nuestra cohorte de pacientes con DF no mostraron diferencias estadísticamente significativas comparadas con el grupo control o por forma clínica de presentación, mostrando una baja sensibilidad como biomarcador de enfermedad. (AU)

Aqueous humor heat-shock protein 70, periostin, and irisin levels in patients with pseudoexfoliation syndrome / Níveis de proteína de choque térmico 70, de periostina e de irisina no humor aquoso em pacientes com pseudoexfoliação

ABSTRACT Purpose: To measure humor heat-shock protein 70, periostin, and irisin levels in patients with pseudoexfoliation syndrome and cataract (without glaucoma), and compare them with those of patients with cataract but without pseudoexfoliation. Methods: We examined 31 eyes of 31 patients with pseudoexfoliation and cataract (without glaucoma) and 30 eyes of 30 patients with cataract. We collected aqueous humor samples from all patients at the time of cataract surgery through a limbal paracentesis via a 25-gauge cannula mounted on a tuberculin syringe that received 100 to 150 µL of aqueous humor. We measured levels of aqueous humor Heat shock protein 70, periostin, and irisin using enzyme-linked immunosorbent assay methods. Results: The age (p=0.221) and gender (p=0.530) means were similar between the pseudoexfoliation and control groups. The mean Heat shock protein 70 level (29.22 ± 9.46 ng/mL; 17.88-74.46) in the pseudoexfoliation group was significantly higher than that in the control group (19.03 ± 7.05 ng/mL; 9.93-35.52; p<0.0001). The mean periostin level was significantly higher (6017.32 ± 1271.79 pg/mL; 3787.50-10803.57) in the pseu doexfoliation group than that in the control group (4073.63 ± 1422.79 pg/mL; 2110.44-7490.64; p<0.0001). The mean irisin level (53.77 ± 10.19 ng/mL; 29.46-71.16) was significantly higher than that in the control group (39.29 ± 13.58 ng/mL; 19.41-70.56; p<0.0001). Conclusions: Heat shock protein 70, periostin, and irisin levels increase in the aqueous humor of patients with pseudoexfoliation without glaucoma.

RESUMO Objetivo: Comparar os níveis de proteína de choque térmico 70, de periostina e de irisina no humor aquoso de pacientes com pseudoexfoliação com catarata sem glaucoma e compará-los com pacientes com catarata sem pseudoexfoliação. Métodos: Trinta e um olhos de 31 pacientes com pseudoexfoliação com catarata sem glaucoma e 30 olhos de 30 indivíduos com catarata foram incluídos neste estudo. Amostras de humor aquoso foram coletadas de todos os pacientes no momento da cirurgia de catarata e obtidas através de uma paracentese límbica por meio de uma cânula de calibre 25 acoplada a uma seringa com tuberculina. Foram coletados 100 a 150 µL de humor aquoso. Os níveis de proteína de choque térmico 70, de periostina e de irisina no humor aquoso foram medidos usando o método de ensaio imunossorvente ligado a enzima. Resultados: A média da idade (p=0,221) e sexo (p=0,530) foram semelhantes entre os grupos pseudoexfoliação e controle. Os níveis médios de proteína de choque térmico 70 foram 29,22 ± 9,46 ng/mL (17,88-74,46) e 19,03 ± 7,05 ng/ mL (9,93-35,52) nos grupos pseudoexfoliação e controle, respectivamente. Os níveis de proteína de choque térmico 70 foram maiores no grupo pseudoexfoliação (p<0,0001). O nível médio de periostina foi de 6017,32 ± 1271,79 pg/mL (3787,50-10803,57) no grupo pseudoexfoliação e 4073,63 ± 1422,79 pg/mL (2110,44-7490,64) no grupo controle. O nível médio de periostina também foi maior no grupo pseudoexfoliação (p<0,0001). Os níveis médios de irisina foram 53,77 ± 10,19 ng/mL (29,46-71,16) e 39,29 ± 13,58 ng/mL (19,41-70,56) nos grupos pseudoexfoliação e controle, respectivamente. O nível médio de irisina foi maior no grupo pseudoexfoliação do que no grupo controle (p<0,0001). Conclusões: Os níveis de proteína de choque térmico 70, de periostina e de irisina aumentam no humor aquoso de pacientes com pseudoexfoliação sem glaucoma.

Dynamic changes of periostin and collagen I in the sclera during progressive myopia in guinea pigs / Alterações dinâmicas de periostina e colágeno I na esclera durante miopia progressiva em cobaias

ABSTRACT Purpose: To investigate periostin and collagen I expression during a scleral remodeling in myopic eyes and to determine their role in collagen remodeling of the myopic sclera. Methods: Fifty one-week-old guinea pigs were divided into the control and form-deprivation myopia (FDM) groups. The eyes of animals in the form-deprivation myopia group were covered for 2, 4, and 8 weeks, or were covered for 4 weeks and then uncovered for 2 weeks. The diopters and axial lengths in the eyes in each group of guinea pigs were measured. Immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction were used to detect the relative protein and mRNA expressions of periostin and collagen I in the scleral tissues of guinea pig. Results: Before masking, guinea pigs in the control and form-deprivation myopia groups were hypermetropic and did not differ significantly (p>0.05). Hypermetropic refraction in the control group gradually decreased. In guinea pigs from the form-deprivation myopia group, the refractive power gradually changed from +2.14 ± 0.33 D to -7.22 ± 0.51 D, and the axial length gradually changed from 5.92 ± 0.37 mm to 8.05 ± 0.34 mm from before until the end of masking. Before covering, no significant difference was observed in the relative collagen I and periostin mRNA and protein expression levels in the sclera of the guinea pig control and form-deprivation myopia groups (p>0.05). The relative collagen I and periostin protein and mRNA expression levels in the sclera of guinea pigs in the form-deprivation myopia group at 2, 4, and 8 weeks, and after covering the eyes for 4 weeks followed by uncovering for 2 weeks, were significantly lower than those in the control group (p<0.05). The collagen I and periostin mRNA expression levels were positively correlated with protein expression levels in the sclera of guinea pigs (protein: r=0.936, p<0.05; mRNA: r=0.909, p<0.05). Conclusions: Periostin was expressed in the myopic sclera of guinea pigs, and changes in periostin and collagen I expression were highly consistent. Periostin and collagen I may be involved in the regulation of scleral remodeling in myopia.

RESUMO Objetivo: Investigar a expressão da periostina e do colágeno I durante o remodelamento escleral em olhos míopes e determinar seu papel na remodelação do colágeno da esclera miópica. Métodos: Cinquenta cobaias com uma semana de idade foram divididas em grupo controle e miopia de privação de forma. Os olhos dos animais no grupo de miopia de privação de forma foram cobertos por 2, 4 e 8 semanas, ou foram cobertos por 4 semanas e depois descobertas por 2 semanas. As dioptrias e comprimentos axiais dos olhos em cada grupo de cobaias foram medidos. A imunohistoquímica e a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa foram utilizadas para detectar as expressões relativas de proteína e mRNA de periostina e colágeno I em tecidos esclerais das cobaias. Resultados: Antes do mascaramento, as cobaias nos grupos controle e miopia de privação de forma eram hipermetrópicas e não diferiam significativamente (p>0,05). A refração hipermetrópica no grupo controle diminuiu gradualmente. Nas cobaias do grupo de miopia de privação de forma, a potência de refração mudou gradualmente de +2,14 ± 0,33 D para -7,22 ± 0,51 D e o comprimento axial mudou gradualmente de 5,92 ± 0,37 mm para 8,05 ± 0,34 mm desde antes até o final do mascaramento. Antes do mascaramento, nenhuma diferença significativa foi observada nos níveis de expressão de mRNA e proteína de colágeno I e periostina na esclera dos grupos controle e miopia de privação de forma (p>0,05). Os níveis relativos de expressão de colágeno I e proteína periostina e mRNA na esclera de cobaias no grupo de miopia de privação de forma em 2, 4 e 8 semanas, e após cobertura dos olhos por 4 semanas seguido de descoberta por 2 semanas, foram significativamente menores que aqueles no grupo controle (p<0,05). Os níveis de expressão de mRNA, colágeno I e proteína periostina foram positivamente correlacionados com os níveis de expressão de proteína na esclera das cobaias (proteína: r=0,936, p<0,05; mRNA: r=0,909, p<0,05). Conclusões: A periostina foi expressa na esclerótica míope de cobaias e as alterações na expressão de periostina e colágeno I foram altamente consistentes. A periostina e o colágeno I podem estar envolvidos na regulação do remodelamento escleral na miopia.

Periostina: su expresión en los procesos de reparación ósea / Periostin expression in bone repair processes: sua expressão nos processos de reparação Óssea / Periostina

La periostina es una proteína no colágena expresada preferentemente en el periostio, que tiene un papel importante en la formación ósea durante la embriogénesis pero también durante la reparación de lesiones óseas o enfermedades metabólicas óseas. En el primer caso, en los procesos de consolidación de fractura, en modelos de animales de experimentación, se observó un incremento de la expresión de periostina inmediatamente posterior a la fractura, lo que sugirió que ésta tendría un papel relevante en la formación del callo óseo periostial durante los estadíos tempranos del proceso de consolidación de fractura. En enfermedades óseas benignas, como la displasia fibrosa, se observó un incremento de la expresión de periostina en el componente fibroso de la lesión, y se la propone como un marcador inmunohistoquímico en los estudios anatomopatológicos. La periostina es un factor soluble que puede ser detectado en sangre periférica. En los últimos años se desarrollaron numerosos inmunoensayos para su medición pero con la limitante que estos miden todas las isoformas circulantes de periostina con lo que se resta especificidad ósea. El desarrollo de nuevos inmunoensayos con mayor especificidad y sensibilidad a los actuales es de crucial importancia para investigar el potencial que tiene la periostina como biomarcador del metabolismo del periostio, calidad y resistencia ósea.

Periostin is a non-collagenous protein expressed mainly in the periosteum, which has an important role during embryonic bone formation but also when repairing bone lesions or metabolic bone diseases. In the first case, when healing fractures and during experimental animal models, a periostin increased expression has been observed immediately after fractures. These findings suggest that periostin may play an important role in periosteal callus formation during the early stage of fracture healing. In benign bone diseases, like fibrous dysplasia, the periostin over-expression was observed in the fibrous component lesion. So, this protein could be detected by immune histochemical technique in histopathology studies. Periostin is a soluble factor, which can be detected in peripheral blood. In recent years, several immunoassays have been developed, though the main limiting factor is the detection of all molecule circulating isoforms, without providing bone specificity. Development of new immunoassays with greater specificity and sensibility than the current ones is crucial to the research concerning the potential of periostin as a biomarker of periosteal metabolism, bone quality and resistance.

Periostina é uma proteína não-colágena que se expressa principalmente no periósteo, o que tem um papel importante na formação óssea durante a embriogênese, mas também durante a reparação de lesões ósseas ou doenças metabólicas ósseas. No primeiro caso, nos processos de consolidação de fratura, em modelos de animais de experimentação, observou-se um aumento na expressão de periostina imediatamente após a fratura, sugerindo que ela teria um papel relevante na formação do calo ósseo periosteal durante as fases precoces do processo de consolidação de fratura. Em doenças ósseas benignas, tais como displasia fibrosa, foi observado um aumento da expressão de periostina no componente fibroso da lesão, propondo-se como um marcador imuno-histoquímico nos estudos anatomo-patológicos. Periostina é um fator solúvel, ele pode ser detectado em sangue periférico tendo sido desenvolvido nos últimos anos inúmeros imunoensaios para sua medição, porém com a limitação de eles medirem todas as isoformas circulantes de periostina tirando-lhe especificidade óssea. Desenvolver novos imunoensaios com maior especificidade e sensibilidade que os atuais é de extrema importância para investigar o potencial que tem a periostina como biomarcador do metabolismo do periósteo, qualidade e ressistência óssea.